الرئيسية
يطلق مصطلح Mycoses على الاصابات الفطرية التي يتراوح مداها بين اصابات سطحية Superficila Mycoses والتي تشمل الجلد واصابات جهازية Systemic mycoses وهي التي تشمل الانسجة والاعضاء الداخلية في الجسم (Edmonds, 1978). وان الفطريات الجلدية Dermatophytes هي مجموعة من الفطريات المترابطة القادرة على غزو الانسجة الكيراتينية من الشعر والجلد والاظافر للإنسان والحيوانات والاصابة التي تحدثها هذه الفطريات تعرف بــ Dermatothytoses أو Ring worm وتضم هذه المجموعة ثلاثة اجناس وهي Trichophyton (Matsumato, 1996) Epidermophyton sp., Microsporum sp., sp.. وان تطور الاصابات الفطرية الجلدية للانسان متعلق بالوضع المناعي للمضيف وعوامل البيئة كالرطوبة ودرجة الحرارة (Evans,1997). راجع موقع حرة للمزيد من المعلومات : تجربتي مع شرب البابونج يوميا
تقسم الفطريات الجلدية على اساس المضيف الطبيعي لها الى ثلاث مجاميع رئيسة هي الانواع التي يكون المضيف لها هو الانسان Anthropophilic وتنتقل عن طريق التلامس مع الاشخاص المصابين والانواع التي يكون المضيف الطبيعي لها الحيوانات Zoophilic ومنها تنتقل الى الانسان عن طريق التعرض لها محدثة اصابة والانواع التي تعيش مترممة في التربة على المواد الكيراتينية منها (الشعر والريش) وتعرف Geophilic ومنها تنتقل الى الانسان أو الحيوانات.
وتسبب الفطريات الحيوانية Zoophilic بشكل عام التهابا اكثر شدة مما تسببه الفطريات البشرية (Hunter et al., 2002). اما الاعفان هي فطريات خيطية ذات هايفات سريعة النمو وهي تنتشر بصورة واسعة في الهواء والتربة فتكون مصدرا للتلوث والاصابة ومن هذه الفطريات (الاعفان) هو جنس Aspergillus الذي يتضمن عشرات الانواع وتتميز بهايفاته المقسمة والتي تتفرع بزاوية 45°م وتنتج كونيدات (سبورات لا جنسية) وان الانواع الثلاثة المهمة في امراضيتها للإنسان هي: A. fumigats, A. niger, A. flavus ويعد فطر A. fumigatus من اهم انواع الفطريات التي توجد في البيئة وبأعداد كبيرة ويمكن لسبوراتها المحمولة بالهواء Airborne ان تسبب حساسية للجهاز التنفسي (Georgopapdakou, 2002) والمسمى بداء الرشاشيات Aspergillosis ويصيب داء الرشاشيات الرضى المثبطين مناعياً(1988، Bodey). والفطر. A fumigatus يسبب داء الرشاشيات الرئوي Pulmonary Aspergillosis الذي يشبه مرض التدرن الرئوي وهو ينتج سموما ضارة ومنها السم gilotoxins و verrucullogen والذي يعود اليه دور الفطر في امراضيته للإنسانKonemanet al., 1979; pitt and Hocking, 1997; Emmons etal, 1970;) Virella, 1997).
كانت وما تزال النباتات الطبية ذات الصفات الدوائية والعلاجية تمثل مستقبل العالم العلاجي على المستوى الوطني والاقليمي والعالمي والدوائي بإعتباره هذه الاعشاب وما تحتويه من المنتجات الثانوية منها الزيوت الطيارة ذات الفعالية البايولوجية بالقدرة الربانية في سرعة الشفاء لفتك الداء لذلك بدأت الدول المتقدمة والنامية بالاهتمام في الوقت الحاضر باستخدام الاعشاب الطبية لما لها من فوائد علاجية لعدم احتوائها على ايه اثار جانبية مصاحبة لها كما يحصل عند استعمال المركبات الكيماوية من الادوية المصنعة.
نبات البابونج Maricaria chamomilla من العائلة المركبة Compositae ويسمى ايضا بزهرة الذهب (Chakravarty, 1976)، البابونج هو نبات عشبي يبلغ ارتفاعه حوالي ما بين (20-50) سم الساق اجرد كثير التفرع ازهاره بيضاء وسطها اصفر رؤوسها زندية انبوبية في وسطها، خيطية في اطرافها وتقوم على كرسي مخروطي اجوف ولها رائحة عطرية نفاذة (قبيسي، 1998) ويعد نبات البابونج من النباتات الطبية الشائعة في اغلب دول العالم ذلك لأنه يحتوي على تنوع عال من المركبات الفعالة، من دراستها تم التعرف على عدد كبير منها والتوصل الى فعاليتها الكيميائية الطبية والعلاجية (مجيد ومحمود، 1988) يتواجد البابونج في جنوب وشرق اوروبا ثم امتدت زراعته الى حوض البحر الابيض المتوسط والولايات المتحدة الامريكية وتعد المانيا والمجر وجزر البلقان والاتحاد السوفيتي السابق من اهم مراكز تجارة البابونج (Franz, 1979).
الجزء الطبي المهم في النبات الذي يستعمل بشكل شائع هو النورات الزهرية بسبب احتوائها على العديد من المواد الفعالة التي يتم الحصول عليها من الازهار الجافة ومن هذه المواد الزيوت الطيارة التي تحتوي على مواد وأحماض عديدة تلعب دورا فعالا خاصة من الناحية الطبية تصل الى 1.5% من مكونات الازهار الجافة كما تحتوي الازهار على الفلافونات (Hydroxyl coumarins). وكذلك تحتوي على مواد هلامية بنسبة 10% اضافة إلى فيتامين C وعناصر حرة تدعى (Newalland Phillpson,1996) Anthemic acid وان الجزء الفعال في البابونج هو الزيت المتطاير Volatile oil ويقدر بـ 0.7% w/v وهو مكون من 8.5% استرات احادية وثنائية الوظيفة Mono and bifuncnional وكذلك الحوامض الاليفاتية والكحولات (Bruneton,1999). وان المكونات الفعالة للبابونج هي اوكسيدات البايسابولول Chamazulene, Apigenin (E)- B- farnesene, bisablon, oxides A,B (Arak, 1981; Revenchon and senatore, 1994). كما وجد بان الرؤوس الزهرية للبابونج تحتوي الزيت المتطاير الازق الذي يحوي على azulene والذي يعرف بالكامازولين علىmatricin, palustrine, herniarin, dihydroxycinamicacid, Quercetol, Apigenine, Flavonoidglucosides, , (مصطفي، 2004؛ Gradiner, 2000) وهذه المشتقات استرات حامض الانجيلك ومنها 2-Methyl, Methylallangelate Mimica-Dukicet al., 2008;) Isomylangelates, Isboutylangelate, Butylangelate Newallet al., 1996 وان الزيت الاساسي يحوي ايضا على تربينات احادية Monoterpens وعلى الازولينات Azulene والكامازولينات Chamazulene والمكونات الاخرى الفعالة المعروفة للنورات الزهرية هي الحوامض الكاربوكسية والفينولية، ومنها الكافيك Caffeic و الفريوليك Ferulic والكوماريدات Comarins والتانيك Tanic والانثيميك Anthemic والفلافونات Flavonoids ومنها الابجينين Apigenin والليوتيولين Leuteolin ومشتقات راتنجية (Lai et al., 2007; Ramos, 1996). ويستخدم البابونج في مجالات كثيرة من الناحية الطبية اذ يعد مزيلا للمغص وآلام المعدة وفاتحا للشهية ومنشطا للدورة الدموية خصوصا عند الاطفال وكعلاج لالتهابات العين، وخافض لدرجات الحرارة ومهدئا للأعصاب وهو معرق ومضاد للتشنج، وطارد للغازات ويستخدم زيته في عمل كمادات لإزالة آلام الصدر عند حصول النزلات الصدرية (المنظمة العربية، 1988؛ Mann and stab,1986).
كما ان ازهارة تستعمل في اوروبا بكثرة كمشروبات بديل الشاي بعد تحليته بالسكر يؤخذ في الصباح ليقي من نزلات البرد ويستخدم في صناعة الروائح العطرية وله استعمال خارجي بشكل لبخات لمعالجة الجروح الصيفية وطارد للبلغم، وبالنظر لاحتواء النورات على صبغات نباتية أو مواد ملونة صفراء تعرف Apigenin لذلك يكثر استخدامه في صناعة مستخضرات التجميل خاصة ما يخص الشعر كالمواد المستخدمة لصباغة الشعر وكذلك مساحيق التجميل الخاصة ببشرة الوجه كالكريمات وصابون الوجه. (منصور، 2005؛ Liang et al.,).
ونظر لأهمية نبات البابونج وتواجده في البيئة وسهولة الحصول عليه ولعدم وجود دراسات سابقة عليه من حيث تأثيره على بعض الفطريات المرضية فقد قمنا بهذه الدراسة والتي تهدف الى:
1- اختبار الفعالية التثبيطية لمستخلص نبات البابونج على بعض الفطريات المرضية.
2- اختبار تأثير المعاملات الحرارية على الفعالية التثبيطية لمستخلص نبات البابونج على بعض الفطريات المرضية.
مواد وطرق البحث:
تم جمع العينات المرضية من المرضى المصابين الذين شخصت اصابتهم بالفطريات المرضية من بعض المراجعين لاستشارية الجلدية في مستشفى الجمهوري التعليمي بالموصل وبعد ان عقمت المنطقة المصابة بكحول اثيلي 70% ثم جمعت العينات من القشطات الجلدية والاظافر ومن القشع Sputum.
عزل الفطريات:
الفحص المجهري المباشر والزرع للعينات:
اخذت كمية قليلة من القشطات الجلدية (Skin scrapins) بواسطة مشرط معقم أو شفرة جراحة (Sterile surgical blades) أو البقايا المتقرنة الرقيقة للأظافر وبواسطة ملقط معقم ووضعت على شريحة زجاجية نظيفة Slides واضيف اليها قطرة من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم 20-10% ثم غطت الشريحة وسخنت بهدوء وذلك بتحريكها فوق لهب مصباح بنزن مرتين أو ثلاث مرات مع تجنب الغليان لأنه يؤدي الى تبلور هيدروكسيد البوتاسيوم لأجل زيادة الترويق ثم تركت لمدة 20 دقيقة و ضغط عليها بلطف بوساطة قاعدة ابرة التلقيح loop لغرض فرش العينة. ثم فحصت جميع الشرائح الزجاجية المحضرة تحت المجهر باستخدام القوى الصغرى (10x) اولا ثم القوى الكبرى (X40) لملاحظة وجود التراكيب الخيطية Hypheae المتفرعة والسبورات المفصيلية Arthrospores Szepietwski and schwart, 2005). وبعدها زرعت العينات الموجبة على طبق بتري يحوي وسط (S.D.A) Sabourands dextrose agar وحضنت الاطباق بدرجة حرارة (2±27.5)°م لمدة 7- 14 يوم بالنسبة للقشطات الجلدية أو البقايا المتقرنة للأظافر وفحصت باستمرار كل 2-3 ايام (Eilabib and khalifa,2001).
اما بالنسبة لعزل الأعفان فقد تم اخذ مسحات الاذن (Ear swabs) من الاذن الخارجية المصابة بوساطة ممسحة قطنية معقمة وتم تعقيم تجويف الفم بالغرغرة بمحلول ملحي في الصباح الباكر واخذت عينات القشع (Sputum) وفحصت بأستخدام المجهر للتحري عن وجود الأعفان و زرعت على وسط معقم ثم حضنت تحت درجة حرارة (2±27.5)°م (Beneke and Rogers, 1980; jawetzet al, 1987) ولمدة اسبوع وتم عزل الفطريات وتنقيتها.
تشخيص الفطريات المعزولة
بعد اكتمال نمو المستعمرات الفطرية المعزولة من الحالات المرضية المختلفة، وتم فحصها مجهريا بأخذ جزء من النمو الفطري بوساطة ابرة تلقيح معقمة Needle ووضع على شريحة زجاجية عليها قطرة من صبغة المثيل الازرق Methylene- blue ونشرت العينة في قطرة التحميل ثم وضع غطاء الشريحة عليها وفحصت مجهريا للتعرف على صفات الغزل الفطري والسبورات وشخصت حسب المفاتيح التصنيفية المعتمدة هي: (Pitt and Hocking, 1997; Forbes et al., 2002; Komemanet al., 1979)
تحضير المستخلص: وتشمل هذه العملية عدة مراحل هي:
1- تحضير المستخلص المائي:
تم تحضير المستخلص المائي من اجزاء النبات المستخدمة (النورات الزهرية) حسب طريقة (Rios et al., 1987) وذلك بمزج (40) غم من مسحوق النموذج النباتي مع (160) مل من الماء المقطر أي بنسبة (4:1) غم: حجم بعد سحق النموذج بوساطة جفنة خزفية ثم اكمل الهرس باستخدام جهاز الخلاط الكهربائي (Blender) من نوع Ultra- Tarax blender Germany وترك المزيج في الثلاجة لمدة 24 ساعة لغرض النقع ورشح بعد ذلك خلال عدة طبقات من الشاش ورشح مرة اخرى بوساطة قمع بوخنر باستخدام ورق الترشيح (Whatman No. 2) تحت التفريغ واخيرا اجري الطرد المركزي للمستخلص لضمان التخلص من الشوائب وبذلك تم الحصول على المستخلص المائي الخام لكل نبات وتم تعبئة المستخلص في قنانئ بلاستيكية سعة (25) مل وتم تجميدها في المجمدة، وضعها في جهاز المجفد Lyophilizer تحت الضغط المتخلخل المجهز من شركة (Edward High Vacuu. V.K) لغرض تجفيفها تحت درجة حرارة (-50)°م حفظت العينات في عبوات بلاستيكية محكمة الغلق تحت التجميد لحين الاستعمال.
2- تعقيم المستخلصات المائية
لغرض تعقيم المستخلص المائي لنبات البابونج اخذ غرام واحد من المستخلص النباتي الخام المجفف واذيب في (5) مل من الماء المقطر وبذلك تم الحصول على مستخلص تركيزه (200) ملغم/ مل كتركيز قياسي، وتم تعقيم هذا المستخلص باستخدام مرشح سايتز الحاوي على مرشح غشائي (Membrane Filters) بقطر (0.22) مايكرون تحت التفريغ ويعد هذا التركيز مصدرا لتحضير التخافيف المستخدمة في الدراسة (النعمان، 1998).
3- اختبار الفعالية التثبيطية للمستخلص المائي للبابونج على بعض الفطريات المرضية:
بعد تحضير المستخلص المائي لنبات البابونج وتعقيمه تم وضع المستخلص المائي في جهاز حمام مائي Water bath تحت درجات حرارة مختلفة هي (25، 50، 75، 100)° س لفترات زمنية مختلفة (5، 7، 10، 15) دقيقة على التوالي، ثم تم اختبار تأثير الفعالية التثبيطية ضد الفطريات المعزولة وذلك بأخذ المستخلص المائي لنبات البابونج المعرض تحت درجات حرارية مختلفة ولفترات زمنية مختلفة (5، 7، 10، 15) دقيقة على التوالي. واضافة اوزان محددة منه الى احجام محددة من الوسط الزرعي (S.D.A) المعقم قبل تصلبة في قناني زجاجية سعة (120) مل وبعد رجها جيدا تم الحصول على التراكيز (5، 10، 15، 20، 25، 30) ملغم/ مل للمستخلص وحسب معادلة N1V1=N2V2 ثم صبت في ثلاثة اطباق بتري بقطر (9) سم وبعد تصلب الوسط أخذ قرص من حافة المستعمرة الفطرية بعمر اسبوع لفطر A.fumigatus ولمدة عشر ايام الى اسبوعين لفطر T.rubrum بواسطة ثاقب فلين (Cork porer) بقطر (5) ملم ووضع القرص في مركز الطبق في ظروف معقمة ثم حضنت الاطباق في درجة حرارة (2±27.5)°م في حاضنة نوع (Memert Germany) لمدة اسبوع لفطر A.fumigatus ولمدة عشرة ايام الى اسبوعين لفطر T.rubrum ثم اخذت النتائج لحساب متوسط قياس قطرين متعامدين لكل مستعمرة فطرية، وبواقع ثلاث مكررات لكل معاملة اما المقارنة control فكانت بدون اضافة المستخلص الى الوسط الرزعي (Pitt and Hocking, 1997).
تقسم الفطريات الجلدية على اساس المضيف الطبيعي لها الى ثلاث مجاميع رئيسة هي الانواع التي يكون المضيف لها هو الانسان Anthropophilic وتنتقل عن طريق التلامس مع الاشخاص المصابين والانواع التي يكون المضيف الطبيعي لها الحيوانات Zoophilic ومنها تنتقل الى الانسان عن طريق التعرض لها محدثة اصابة والانواع التي تعيش مترممة في التربة على المواد الكيراتينية منها (الشعر والريش) وتعرف Geophilic ومنها تنتقل الى الانسان أو الحيوانات.
وتسبب الفطريات الحيوانية Zoophilic بشكل عام التهابا اكثر شدة مما تسببه الفطريات البشرية (Hunter et al., 2002). اما الاعفان هي فطريات خيطية ذات هايفات سريعة النمو وهي تنتشر بصورة واسعة في الهواء والتربة فتكون مصدرا للتلوث والاصابة ومن هذه الفطريات (الاعفان) هو جنس Aspergillus الذي يتضمن عشرات الانواع وتتميز بهايفاته المقسمة والتي تتفرع بزاوية 45°م وتنتج كونيدات (سبورات لا جنسية) وان الانواع الثلاثة المهمة في امراضيتها للإنسان هي: A. fumigats, A. niger, A. flavus ويعد فطر A. fumigatus من اهم انواع الفطريات التي توجد في البيئة وبأعداد كبيرة ويمكن لسبوراتها المحمولة بالهواء Airborne ان تسبب حساسية للجهاز التنفسي (Georgopapdakou, 2002) والمسمى بداء الرشاشيات Aspergillosis ويصيب داء الرشاشيات الرضى المثبطين مناعياً(1988، Bodey). والفطر. A fumigatus يسبب داء الرشاشيات الرئوي Pulmonary Aspergillosis الذي يشبه مرض التدرن الرئوي وهو ينتج سموما ضارة ومنها السم gilotoxins و verrucullogen والذي يعود اليه دور الفطر في امراضيته للإنسانKonemanet al., 1979; pitt and Hocking, 1997; Emmons etal, 1970;) Virella, 1997).
كانت وما تزال النباتات الطبية ذات الصفات الدوائية والعلاجية تمثل مستقبل العالم العلاجي على المستوى الوطني والاقليمي والعالمي والدوائي بإعتباره هذه الاعشاب وما تحتويه من المنتجات الثانوية منها الزيوت الطيارة ذات الفعالية البايولوجية بالقدرة الربانية في سرعة الشفاء لفتك الداء لذلك بدأت الدول المتقدمة والنامية بالاهتمام في الوقت الحاضر باستخدام الاعشاب الطبية لما لها من فوائد علاجية لعدم احتوائها على ايه اثار جانبية مصاحبة لها كما يحصل عند استعمال المركبات الكيماوية من الادوية المصنعة.
نبات البابونج Maricaria chamomilla من العائلة المركبة Compositae ويسمى ايضا بزهرة الذهب (Chakravarty, 1976)، البابونج هو نبات عشبي يبلغ ارتفاعه حوالي ما بين (20-50) سم الساق اجرد كثير التفرع ازهاره بيضاء وسطها اصفر رؤوسها زندية انبوبية في وسطها، خيطية في اطرافها وتقوم على كرسي مخروطي اجوف ولها رائحة عطرية نفاذة (قبيسي، 1998) ويعد نبات البابونج من النباتات الطبية الشائعة في اغلب دول العالم ذلك لأنه يحتوي على تنوع عال من المركبات الفعالة، من دراستها تم التعرف على عدد كبير منها والتوصل الى فعاليتها الكيميائية الطبية والعلاجية (مجيد ومحمود، 1988) يتواجد البابونج في جنوب وشرق اوروبا ثم امتدت زراعته الى حوض البحر الابيض المتوسط والولايات المتحدة الامريكية وتعد المانيا والمجر وجزر البلقان والاتحاد السوفيتي السابق من اهم مراكز تجارة البابونج (Franz, 1979).
الجزء الطبي المهم في النبات الذي يستعمل بشكل شائع هو النورات الزهرية بسبب احتوائها على العديد من المواد الفعالة التي يتم الحصول عليها من الازهار الجافة ومن هذه المواد الزيوت الطيارة التي تحتوي على مواد وأحماض عديدة تلعب دورا فعالا خاصة من الناحية الطبية تصل الى 1.5% من مكونات الازهار الجافة كما تحتوي الازهار على الفلافونات (Hydroxyl coumarins). وكذلك تحتوي على مواد هلامية بنسبة 10% اضافة إلى فيتامين C وعناصر حرة تدعى (Newalland Phillpson,1996) Anthemic acid وان الجزء الفعال في البابونج هو الزيت المتطاير Volatile oil ويقدر بـ 0.7% w/v وهو مكون من 8.5% استرات احادية وثنائية الوظيفة Mono and bifuncnional وكذلك الحوامض الاليفاتية والكحولات (Bruneton,1999). وان المكونات الفعالة للبابونج هي اوكسيدات البايسابولول Chamazulene, Apigenin (E)- B- farnesene, bisablon, oxides A,B (Arak, 1981; Revenchon and senatore, 1994). كما وجد بان الرؤوس الزهرية للبابونج تحتوي الزيت المتطاير الازق الذي يحوي على azulene والذي يعرف بالكامازولين علىmatricin, palustrine, herniarin, dihydroxycinamicacid, Quercetol, Apigenine, Flavonoidglucosides, , (مصطفي، 2004؛ Gradiner, 2000) وهذه المشتقات استرات حامض الانجيلك ومنها 2-Methyl, Methylallangelate Mimica-Dukicet al., 2008;) Isomylangelates, Isboutylangelate, Butylangelate Newallet al., 1996 وان الزيت الاساسي يحوي ايضا على تربينات احادية Monoterpens وعلى الازولينات Azulene والكامازولينات Chamazulene والمكونات الاخرى الفعالة المعروفة للنورات الزهرية هي الحوامض الكاربوكسية والفينولية، ومنها الكافيك Caffeic و الفريوليك Ferulic والكوماريدات Comarins والتانيك Tanic والانثيميك Anthemic والفلافونات Flavonoids ومنها الابجينين Apigenin والليوتيولين Leuteolin ومشتقات راتنجية (Lai et al., 2007; Ramos, 1996). ويستخدم البابونج في مجالات كثيرة من الناحية الطبية اذ يعد مزيلا للمغص وآلام المعدة وفاتحا للشهية ومنشطا للدورة الدموية خصوصا عند الاطفال وكعلاج لالتهابات العين، وخافض لدرجات الحرارة ومهدئا للأعصاب وهو معرق ومضاد للتشنج، وطارد للغازات ويستخدم زيته في عمل كمادات لإزالة آلام الصدر عند حصول النزلات الصدرية (المنظمة العربية، 1988؛ Mann and stab,1986).
كما ان ازهارة تستعمل في اوروبا بكثرة كمشروبات بديل الشاي بعد تحليته بالسكر يؤخذ في الصباح ليقي من نزلات البرد ويستخدم في صناعة الروائح العطرية وله استعمال خارجي بشكل لبخات لمعالجة الجروح الصيفية وطارد للبلغم، وبالنظر لاحتواء النورات على صبغات نباتية أو مواد ملونة صفراء تعرف Apigenin لذلك يكثر استخدامه في صناعة مستخضرات التجميل خاصة ما يخص الشعر كالمواد المستخدمة لصباغة الشعر وكذلك مساحيق التجميل الخاصة ببشرة الوجه كالكريمات وصابون الوجه. (منصور، 2005؛ Liang et al.,).
ونظر لأهمية نبات البابونج وتواجده في البيئة وسهولة الحصول عليه ولعدم وجود دراسات سابقة عليه من حيث تأثيره على بعض الفطريات المرضية فقد قمنا بهذه الدراسة والتي تهدف الى:
1- اختبار الفعالية التثبيطية لمستخلص نبات البابونج على بعض الفطريات المرضية.
2- اختبار تأثير المعاملات الحرارية على الفعالية التثبيطية لمستخلص نبات البابونج على بعض الفطريات المرضية.
مواد وطرق البحث:
تم جمع العينات المرضية من المرضى المصابين الذين شخصت اصابتهم بالفطريات المرضية من بعض المراجعين لاستشارية الجلدية في مستشفى الجمهوري التعليمي بالموصل وبعد ان عقمت المنطقة المصابة بكحول اثيلي 70% ثم جمعت العينات من القشطات الجلدية والاظافر ومن القشع Sputum.
عزل الفطريات:
الفحص المجهري المباشر والزرع للعينات:
اخذت كمية قليلة من القشطات الجلدية (Skin scrapins) بواسطة مشرط معقم أو شفرة جراحة (Sterile surgical blades) أو البقايا المتقرنة الرقيقة للأظافر وبواسطة ملقط معقم ووضعت على شريحة زجاجية نظيفة Slides واضيف اليها قطرة من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم 20-10% ثم غطت الشريحة وسخنت بهدوء وذلك بتحريكها فوق لهب مصباح بنزن مرتين أو ثلاث مرات مع تجنب الغليان لأنه يؤدي الى تبلور هيدروكسيد البوتاسيوم لأجل زيادة الترويق ثم تركت لمدة 20 دقيقة و ضغط عليها بلطف بوساطة قاعدة ابرة التلقيح loop لغرض فرش العينة. ثم فحصت جميع الشرائح الزجاجية المحضرة تحت المجهر باستخدام القوى الصغرى (10x) اولا ثم القوى الكبرى (X40) لملاحظة وجود التراكيب الخيطية Hypheae المتفرعة والسبورات المفصيلية Arthrospores Szepietwski and schwart, 2005). وبعدها زرعت العينات الموجبة على طبق بتري يحوي وسط (S.D.A) Sabourands dextrose agar وحضنت الاطباق بدرجة حرارة (2±27.5)°م لمدة 7- 14 يوم بالنسبة للقشطات الجلدية أو البقايا المتقرنة للأظافر وفحصت باستمرار كل 2-3 ايام (Eilabib and khalifa,2001).
اما بالنسبة لعزل الأعفان فقد تم اخذ مسحات الاذن (Ear swabs) من الاذن الخارجية المصابة بوساطة ممسحة قطنية معقمة وتم تعقيم تجويف الفم بالغرغرة بمحلول ملحي في الصباح الباكر واخذت عينات القشع (Sputum) وفحصت بأستخدام المجهر للتحري عن وجود الأعفان و زرعت على وسط معقم ثم حضنت تحت درجة حرارة (2±27.5)°م (Beneke and Rogers, 1980; jawetzet al, 1987) ولمدة اسبوع وتم عزل الفطريات وتنقيتها.
تشخيص الفطريات المعزولة
بعد اكتمال نمو المستعمرات الفطرية المعزولة من الحالات المرضية المختلفة، وتم فحصها مجهريا بأخذ جزء من النمو الفطري بوساطة ابرة تلقيح معقمة Needle ووضع على شريحة زجاجية عليها قطرة من صبغة المثيل الازرق Methylene- blue ونشرت العينة في قطرة التحميل ثم وضع غطاء الشريحة عليها وفحصت مجهريا للتعرف على صفات الغزل الفطري والسبورات وشخصت حسب المفاتيح التصنيفية المعتمدة هي: (Pitt and Hocking, 1997; Forbes et al., 2002; Komemanet al., 1979)
تحضير المستخلص: وتشمل هذه العملية عدة مراحل هي:
1- تحضير المستخلص المائي:
تم تحضير المستخلص المائي من اجزاء النبات المستخدمة (النورات الزهرية) حسب طريقة (Rios et al., 1987) وذلك بمزج (40) غم من مسحوق النموذج النباتي مع (160) مل من الماء المقطر أي بنسبة (4:1) غم: حجم بعد سحق النموذج بوساطة جفنة خزفية ثم اكمل الهرس باستخدام جهاز الخلاط الكهربائي (Blender) من نوع Ultra- Tarax blender Germany وترك المزيج في الثلاجة لمدة 24 ساعة لغرض النقع ورشح بعد ذلك خلال عدة طبقات من الشاش ورشح مرة اخرى بوساطة قمع بوخنر باستخدام ورق الترشيح (Whatman No. 2) تحت التفريغ واخيرا اجري الطرد المركزي للمستخلص لضمان التخلص من الشوائب وبذلك تم الحصول على المستخلص المائي الخام لكل نبات وتم تعبئة المستخلص في قنانئ بلاستيكية سعة (25) مل وتم تجميدها في المجمدة، وضعها في جهاز المجفد Lyophilizer تحت الضغط المتخلخل المجهز من شركة (Edward High Vacuu. V.K) لغرض تجفيفها تحت درجة حرارة (-50)°م حفظت العينات في عبوات بلاستيكية محكمة الغلق تحت التجميد لحين الاستعمال.
2- تعقيم المستخلصات المائية
لغرض تعقيم المستخلص المائي لنبات البابونج اخذ غرام واحد من المستخلص النباتي الخام المجفف واذيب في (5) مل من الماء المقطر وبذلك تم الحصول على مستخلص تركيزه (200) ملغم/ مل كتركيز قياسي، وتم تعقيم هذا المستخلص باستخدام مرشح سايتز الحاوي على مرشح غشائي (Membrane Filters) بقطر (0.22) مايكرون تحت التفريغ ويعد هذا التركيز مصدرا لتحضير التخافيف المستخدمة في الدراسة (النعمان، 1998).
3- اختبار الفعالية التثبيطية للمستخلص المائي للبابونج على بعض الفطريات المرضية:
بعد تحضير المستخلص المائي لنبات البابونج وتعقيمه تم وضع المستخلص المائي في جهاز حمام مائي Water bath تحت درجات حرارة مختلفة هي (25، 50، 75، 100)° س لفترات زمنية مختلفة (5، 7، 10، 15) دقيقة على التوالي، ثم تم اختبار تأثير الفعالية التثبيطية ضد الفطريات المعزولة وذلك بأخذ المستخلص المائي لنبات البابونج المعرض تحت درجات حرارية مختلفة ولفترات زمنية مختلفة (5، 7، 10، 15) دقيقة على التوالي. واضافة اوزان محددة منه الى احجام محددة من الوسط الزرعي (S.D.A) المعقم قبل تصلبة في قناني زجاجية سعة (120) مل وبعد رجها جيدا تم الحصول على التراكيز (5، 10، 15، 20، 25، 30) ملغم/ مل للمستخلص وحسب معادلة N1V1=N2V2 ثم صبت في ثلاثة اطباق بتري بقطر (9) سم وبعد تصلب الوسط أخذ قرص من حافة المستعمرة الفطرية بعمر اسبوع لفطر A.fumigatus ولمدة عشر ايام الى اسبوعين لفطر T.rubrum بواسطة ثاقب فلين (Cork porer) بقطر (5) ملم ووضع القرص في مركز الطبق في ظروف معقمة ثم حضنت الاطباق في درجة حرارة (2±27.5)°م في حاضنة نوع (Memert Germany) لمدة اسبوع لفطر A.fumigatus ولمدة عشرة ايام الى اسبوعين لفطر T.rubrum ثم اخذت النتائج لحساب متوسط قياس قطرين متعامدين لكل مستعمرة فطرية، وبواقع ثلاث مكررات لكل معاملة اما المقارنة control فكانت بدون اضافة المستخلص الى الوسط الرزعي (Pitt and Hocking, 1997).
